Система CRISPR-Cas Streptococcus pyogenes.

РНК-управляемая нуклеаза Cas9 широко используется для введения генетических модификаций в различные клетки и организмы, от бактерий и дрожжей до обезьяны и клеточных линий человека. Высокая эффективность и простота метода редактирования генома Cas9 увеличили возможности генной терапии человека.

Функция Cas9 в Streptococcus pyogenes.

Нуклеаза является центральным игроком адаптивного иммунитета, который обеспечивается кластеризованным локусами коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами - CRISPR. Эти локусы состоят из коротких повторяющихся последовательностей (30-40 п.н.), которые интеркалируются одинаково короткими последовательностями вирусного (бактериофаг) и плазмидного происхождения, называются «спейсерами». Присутствие спейсерной последовательности, которая соответствует геному бактериофага или конъюгативной плазмиды, предотвращает заражение хозяина этими генетическими захватчиками. Следовательно, спейсеры обеспечивают специфический для последовательности иммунитет против инфекции бактериофагами и плазмидами. Важно отметить, что в процессе, известном как адаптация, новые спейсеры могут быть введены в локус CRISPR во время инфекции. Таким образом, система CRISPR создает память об инфекции, которая используется для обеспечения иммунитета при последующих встречах с таким же или родственным агентом.

Спейсерная последовательность, ведущая к иммунитету.

Локус CRISPR обычно производит транскрипцию в длинную РНК предшественника, которая содержит как повторения, так и проставки. Этот предшественник впоследствии расщепляется в повторных последовательностях, чтобы освободить небольшие CRISPR RNAS, которые содержат промежуточную последовательность спейсеров. Расщепление обычно осуществляется с помощью CRISPR, связанного с (Cas), повторными эндорибонуклеазами. CRISPR RNAS образует комплекс рибонуклеопротеина с эффекторной нуклеазой Cas, который обнаруживает его мишень (протоспейсер) посредством основания последовательности проставки в CRISPR RNAS и генома захватчика и продолжает ее расщеплять. Разрушение вирусной или плазмидной ДНК останавливает инфекцию и дает иммунитет хозяину. Как и ожидалось от любого взаимодействия с хозяином-патогеном, это событие является лишь первым шагом в гонке вооружений между системами CRISPR-Cas хозяина и экстрахромосомными захватчиками, поскольку бактериофаги и плазмиды могут развиваться путем генерации мутаций в целевом месте, которые предотвращают идеальное поражение с проставкой последовательности CRISPR RNAS. Эти мутации позволяют захватчику избежать иммунитета CRISPR-Cas и восстановить инфекцию. Цикл перезагружается, когда система CRISPR-Cas приобретает новую последовательность спейсеров, которая идеально сочетается с геномом.

Организация локуса S. pyogenes SF370 CRISPR-Cas. Он содержит четыре гена Сas, кодирующих белок, ген tracrRNA и семь повторов, вставленные шестью спейсерными последовательностями. Биогенез crRNA начинается с транскрипции длинного предшественника crRNA, повторы которого образуют dsRNA с комплементарными последовательностями, присутствующими в tracrRNA, которая связана Cas9. Расщепление этой dsРНК РНКазой III отделяет каждую последовательность спейсера от предшественника с образованием комплекса Cas9-tracrRNA-crRNA, готового для наблюдения и атаки чужеродных генетических элементов, содержащих последовательность, комплементарную спейсеру crРНК.

Расщепление Cas9 ДНК-мишени. Рибонуклеопротеиновый комплекс Cas9 сканирует молекулы двухцепочечной ДНК на наличие последовательности PAM (NGG). За связыванием PAM следует попытка спаривания crРНК с целевой цепью ДНК. При продуктивном отжиге образуется R-петлевая структура, и Cas9 приступает к расщеплению каждой цепи ДНК с использованием разных нуклеазных доменов: RuvC расщепляет PAM-содержащую, смещенную или нецелевую цепь, а HNH — целевую цепь.

Выводы.

Генетический анализ системы CRISPR S.thermophilus показал, что Cas9 является единственным геном Cas, необходимым для интерференционной фазы иммунитета CRISPR. По иронии судьбы, организм, ответственный за некоторые из наиболее распространенных инфекционных заболеваний в мире, может содержать лекарство от ряда генетических заболеваний. Эта ирония подчеркивает важность исследования, проведенного с S. pyogenes и другими бактериальными патогенами, которые могут не только обеспечить новые методы лечения для борьбы с заболеваниями, но также могут привести к новым генетическим инструментам, которые могут произвести революцию в медицине.