Системная органопротекция в реаниматологии на основе целенаправленного мониторинга и регуляции дисбаланса метаболом/микробиом. Часть 2

Результаты научно-исследовательской работы. Часть 2.

Методы исследования.

Обследование пациентов в условиях стационара осуществлялось  комплексно с применением стандартных методов. В процессе клинико-лабораторного мониторинга наряду с проведением  клинических анализов крови и мочи, оценки системы гемостаза, определения биохимических показателей,  в плановом порядке по показаниям выполнялись также микробиологические исследования (выделение, идентификация микроорганизмов, определение их чувствительности к антимикробным препаратам) в соответствии с общепринятыми правилами забора, хранения, транспортировки и работы с микробиологическими образцами. Результаты планового обследования зафиксированы в медицинской документации (истории болезни) каждого пациента.

Для исследования сывороточного содержиния искомых метаболитов и биомаркеров замораживали 0,3 мл сыворотки из образцов венозной крови, набранной для выполнения плановых лабораторных анализов, коллекцию образцов сохраняли в морозильной камере при температуре минус 20°С; размораживали непосредственно перед определением.

В дополнение к сыворотке крови, забраны образцы кишечного содержимого шпателем по 2-3г (собраны при естественной дефекации). Далее образцы распределялись по 1 г в 2 пробирки типа Эппендорф и также подвергались заморозке при минус 20°C.

Образцы сывороток крови и кишечного содержимого забирались у пациентов в динамике, при поступлении и выписке из стационара.

Для оценки  таксономического состава и видового разнообразия использован метод  16S рРНК секвенирования на платформе Illumina MiSeq.

Секвенирование по 16S рРНК оценивает  состав прокариотического микробного сообщества, важно что определяются и   некультивируемые виды.  Для исследования и  последующего анализа используется  саму рибосомальную РНК, присуствующая  в любой клетке в значительно большем  количестве, чем соответствующий ей ген. Нуклеотидные последовательности 16S рРНК всех известных бактерий и архей общедоступны. Выявленные последовательности сравнили с имеющимися в базах данных и идентифицировали вид бактерии или определили ее принадлежность к некультивируемому виду.

Использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).  Минимальные количества ДНК возбудителя могут быть идентифицированы за счет многократного копирования специфических последовательностей генетического материала искомого микроорганизма. Метод ПЦР позволил обнаружить бактериальную и грибковую ДНК с высокой чувствительностью. Для пациентов с тяжелым повреждением головного мозга преимуществом ПЦР-диагностики явилось независимость от проводимой антимикробной терапии, а также возможность получения важной диагностической информации в случаях микст-инфекций.  Газохроматографический анализ сыворотки крови осуществляли в лаборатории метаболизма при критических состояний ФГБНУ НИИ ОР им. В.А. Неговского  ФНКЦ РР на газовом хроматографе газовом хроматомасс-спектрометре фирмы Thermo Scientific, включающем газовый хроматограф Trace GC 1310 и масс-спектрометрический детектор ISQ LT (Thermo Electron Corporation, США). Разработан и адаптирован  к условиям клинической лаборатории методик газохроматографического определения фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови.В образцах сыворотки венозной крови определяли концентрации фенилмолочной (ФМК), гидроксифенилмолочной (п-ГФМК), гидроксифенилуксусной (п-ГФУК) кислот, рассчитывали их сумму. Концентрации, характерные для сыворотки крови здоровых людей, представлены далее. Интерквартильный размах  (ИР 25%75%)  у здоровых добровольцев составил для ФМК 0,46 – 0,82 мкМ (медиана 0,63 мкМ), для п-ГФУК 0,68-1,48 мкМ (медиана 0,98 мкМ), для п-ГФМК 1,09-1,78 мкМ (медиана 1,47).

Концентрацию прокальцитонина (РСТ) и белка S100 определяли на иммунохимическом анализаторе Cobas e411. Исследования проведены на базе лаборатории метаболизма при критических состояниях ФГБУ НИИ ОР ФНКЦ РР.

Прокальцитонина (РСТ), который  является наиболее специфичным маркером бактериальной инфекции, отражает степень бактериальной нагрузки. Тест на РСТ  включен в протоколы антибиотикотерапии для оценки выраженности инфекционно-воспалительного процесса при поступлении в отделение, и в динамике – для объективного мониторинга эффективности лечения. Уровень РСТ в пределах 0 - 0,25 нг/мл свидетельствует о том, что:

 а) наличие инфекционно-воспалительного процесса бактериальной этиологии маловероятно или

б) проводимая антибиотикотерапия адекватна.

Высокие уровни РСТ > 2 нг/мл указывают на наличие бактериальной нагрузки и, как правило, с учетом клинической картины, являются показанием к назначению антибиотикотерапии. РСТ > 10 нг/мл расценивают как текущий септический процесс.

Белок S100 – альтернативный и прямой индикатор повреждения клеток нервной системы, опережающий клинические и радиологические методы оценки, дополнительным преимуществом, которого является возможность количественной оценки степени повреждений мозга. Белки S100 рассматриваются в качестве одного из узловых молекулярных компонентов сложных внутриклеточных систем, обеспечивающих функциональный гомеостаз клеток мозга.

Активность лейкоцитарной эластазы (ЛЭ) и а1-протеиназного ингибитора (а1-ПИ) определяли спектрофотометрически.

Уровни аутоантител к белку S100 и основному белку миелина (ОБМ) – методом иммуноферментного анализа в модификации.

Заключение: применение интегративным методов исследования позволило выделить значимые метаболиты микробиоты и биомаркеры.